需求领域：生物医药大健康;生物医药
背景＆内容：湖北共同药业股份有限公司历经多年的自主研发和技术引进，率先实现了生物制药技术在甾体药物领域的规模化应用。公司已经建立了以廉价的植物甾醇作为起始原料，利用微生物发酵技术成功制备了雄烯二酮（AD）、9α-羟基雄烯二酮（9α-OH-AD）和雄二烯二酮（ADD）等多种甾体关键中间体，已经发展为中国最大的甾体药物关键中间体的生产商之一。但是，在生物转化过程中，由于专有微生物的缺陷，导致底物转化率低、发酵液中目标产物纯度低、副产物含量高、产物降解等原因，与国际先进工艺存在一定的差距。因此，如何获得高效、专一的性的优良菌种成为了公司“卡脖子”问题。因此急需有能力的相关机构或科研人员帮助公司解决这一掐脖子核心技术瓶颈，推动甾体行业技术升级。公司具体技术需要包括：

1、微生物转化植物甾醇为雄烯二酮（AD）技术改进

AD作为一种关键甾体药物中间体，主要用来合成雄性激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物。目前公司已经开发出了利用植物油脂加工后的下脚料植物甾醇为原料，通过微生物转化技术选择性切除植物甾醇侧链制备AD工艺，工艺水平处于国内领先，目前年产量达到500吨以上。但是，在工业化生产中我们发现，在微生物转化植物甾醇生成AD的过程，同时产生了ADD、9α-OH-AD和4-BNA等杂质，使目标产物AD在发酵液中的纯度为85 %左右，给目标产物AD的分离提取带来了极大地困难，严重影响了AD的质量和收率。

我们希望利用先进的代谢工程等手段来改造目前的生产菌株，比如：通过敲除菌株中甾体1,2位脱氢酶基因，使产物AD不会进一步转化为ADD，减少副产物ADD的积累；敲除甾体9α羟基化酶基因，使产物AD不会进一步转化为9α-OH-AD，减少副产物9α-OH-AD的积累；过表达AD合成途径中的关键酶酰基-CoA脱氢酶和烯酰-CoA 水合酶基因，使甾醇降解产物尽可能生成目前产物AD，减少副产物4-BNA的生成。希望改造后的基因工程菌株的发酵液中AD的纯度达到95 %以上， AD的质量收率提高10%以上。

2、微生物转化植物甾醇为9α-羟基雄烯二酮（9α-OH-AD）技术改进

9α-OH-AD也是一种关键甾体中间体，主要用来合成氢化可的松、倍他米松、地塞米松、可的松等皮质类激素药物。目前公司也已经成功的开发出了利用廉价的植物甾醇为原料，通过微生物转化技术制备9α-OH-AD工艺，工艺水平达到国内领先，目前年产量达到300吨以上。同样，我们在工业化生产中发现，在微生物转化植物甾醇生成9α-OH-AD的过程，同时产生了AD、睾酮和9α-OH-BNA等杂质，导致9α-OH-AD在发酵液中的纯度仅为82 %左右，严重影响9α-OH-AD的质量和收率。

我们希望利用先进的代谢工程等手段来改造公司的生产菌株，比如：通过强化菌株中9α羟基化酶基因表达，使AD能够进一步转化为9α-OH-AD，减少副产物AD的积累；过表达17β-羟基甾体脱氢酶基因，使睾酮能够进一步转化为9α-OH-AD，减少副产物睾酮积累；通过敲除硫解酶基因Ltps，减少副产物9α-OH-BNA的生成。希望改造后工程菌株的发酵液中9α-OH-AD的纯度达到95 %以上， 9α-OH-AD的质量收率提高10%以上。
需解决的主要技术难题：科学问题：对微生物植物甾醇代谢机制进行进一步解析，挖掘出与C19和C22类重要甾体药物中间体积累、产物降解和杂质形成相关的关键酶基因。

共性关键技术1：建立高效的适用于工业菌株分支杆菌的基因敲除和基因高效表达的基因编辑系统，是该项目的共性关键技术之一。

共性关键技术2：如何通过筛选或者突变获得高活性的9α羟基化酶基因和硫解酶基因，也是该项目的共性关键技术之一。