中图分类：Q939.95

学科分类：180.61

成果类别：应用技术

成果水平：未评价

研究起止时间：2013-01～2015-12

评价形式：验收

本研究受海南省自然科学基金资助。 芒果等热带水果和蔬菜易受多种病害的为害,为控制病害,以及尽可能少的使用化学杀菌剂,生物防治热带果蔬采后病害意义重大。 本研究旨在通过in vitro 和 in vivo的方法从海南地区果实表面和伤口处筛选出对芒果采后炭疽病具有生防潜力的拮抗酵母菌,同时对其进行鉴定,研究了该酵母拮抗菌对芒果采后炭疽病的抑病机理,并对酵母拮抗菌与外源物质配合使用,以及对该酵母拮抗菌通过抗逆性改良途径来提高其生防能力等进行了研究。实验结果如下： 1、从海南地区果实表面和伤口处共分离到130 株酵母菌,通过平板对峙法和活体筛选法筛选到4株有较好抑菌活性的生防酵母,其中效果最好的1 株酵母菌（编号LZ5）,通过形态学、生理生化及26S rRNA D1/D2分子鉴定为季也蒙毕赤氏酵母Meyerozyma guilliermondii LZ5,该菌株对芒果采后炭疽病表现出明显的抑制效果,在离体条件下抑菌圈直径可达到13.2 mm,而在活体条件下,芒果果实的发病率和病斑直径仅分别为60%和4.27mm。 2、浓度为1×108 CFU/mL的拮抗菌M.guilliermondii LZ5培养原液和悬浮液在离体条件下,能够显著抑制病原菌C.gloeosporioides孢子萌发和芽管的伸长,而灭菌原液和培养滤液则无抑制效果。扫描电镜结果显示,在芒果果实伤口处拮抗菌M.guilliermondii LZ5能够显著抑制病原菌的生长。拮抗菌M.guilliermondii LZ5的接种浓度对生防效果密切相关,其中,使用浓度越高发病率和病斑直径就越小。拮抗菌M.guilliermondii LZ5在果实伤口处能够快速繁殖且不受病原菌C.gloeosporioides的影响,其中在接种后第48h后拮抗菌数量达到最大值,之后数量能够保持在较高的水平。相比于对照果实,拮抗菌M.guilliermondii LZ5能够显著诱导芒果果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的升高。 3、外源物质氯化钙（CaCl2,4%）通过直接抑制炭疽病原菌的生长和促进拮抗菌的增殖以及提高芒果果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性以及几丁质酶（CHI）和过氧化物酶（POD）基因的表达。从而显著提高拮抗菌M.guilliermondii LZ5对芒果采后炭疽病的防治效果。 4、构建pFL61-neo-tps1表达载体,并将该表达载体利用醋酸锂转化法转化M.guilliermondii LZ5。结果发现,带有pFL61-neo-tps1表达载体的转化子能够在250g/mL G418培养基中正常生长,酵母转化子在非选择性培养条件下连续生长50代后,仍有65.5%的细胞保留该质粒。以上结果表明pFL61穿梭质粒适合于野生型拮抗酵母的转化,G418抗性可作为转化子的阳性筛选标记,带有pFL61-neo-tps1表达载体的M.guilliermondii LZ5转化子中,海藻糖-6-磷酸合成酶的过表达能够提高转化子对热休克（48℃）、高渗胁迫（8%NaCl）和致死乙醇浓度（15%）的耐受性,从而增强酵母的存活率。该结果对获得具备强抗逆能力,高抑病作用的工程酵母菌有较大意义。 该项目已作为支撑内容之一获2015年海南省科技进步三等奖。后续研究工作得到国家自然科学基金和农业部2016预算项目,海南省科技厅重点科技合作项目的支持。