3月1日，《Nature Methods》（自然—方法）以长文形式刊发了中国科学院院士、海南大学校长骆清铭教授团队的最新研究成果。论文题为“High-definition imaging using line-illumination modulation microscopy”（用线照明调制显微术实现高清成像），开发了线照明调制显微术并实现了高清成像。

光学显微镜是在亚微米分辨率开展生物医学研究的重要工具。生物组织的精细结构复杂多样，如何在三维空间用光学方法对其进行全面准确观测是公认的难题。形态复杂的神经元是大脑基本的功能单元，如何获取其完整结构对现有技术提出了极大的挑战。

荧光标记的神经元胞体直径约为10-20微米，从胞体伸展出去的轴突和众多的分支纤维直径只有0.2-0.5微米，且多会投射到全脑的不同脑区。胞体与纤维在亮度上相差2-3个数量级，空间分布常常又是交织在一起。当有周边胞体的干扰下若要探测轴突上的微弱荧光信号，就如同在明亮的太阳周边观察小星星。对此类情况，传统的光学层析方法难以实现。骆清铭团队提出了一种高清晰度、高通量的光学层析显微成像新方法——线照明调制光学层析成像（Line illumination microscopy, LiMo）。他们巧妙地将线照明光强的高斯分布作为一种天然的照明强度调制模式，不同照明强度只对焦面上的信号产生相应调制，而对焦外背景信号不调制。因此，采用多线探测的方式可以一次性记录这些被不同强度调制的信号，并且只需要最简洁的一步线性计算，即可去除相同的焦外背景信号，获得清晰的焦面光学层析图像。

与在生物医学中广泛使用的激光点共聚焦扫描显微成像、双光子激发荧光显微成像、激光线共聚焦扫描显微成像和结构光光学层析成像等经典方法相比，经理论推导证明LiMo的背景信号具有更快的衰减系数。通过实验测试也证明了这一结论，LiMo方法的信背比相比上述传统方法提高了1-2个数量级。

该方法只需要简单的多线探测线照明光路，克服了传统结构光照明成像中存在残留调制伪影的固有缺陷，也无需多次成像即可获得所需数据，并具有线扫描对大范围样本成像通量高的优点，解决了传统荧光显微光学层析成像方法无法同时兼顾高分辨率、高通量和高清晰度的问题。可以说该方法不论是光路还是算法，都充分体现了技术的简洁之美。

图1 LiMo显微成像原理示意图和性能测试结果

骆清铭团队基于此进一步发展了高清荧光显微光学切片断层成像技术（High-definition fluorescent micro-optical sectioning tomography, HD-fMOST），将全脑光学成像从高分辨率提升到高清晰度的新标准。近年来全脑光学成像为生物医学研究带来前所未有的丰富细节的同时，也产生数据量巨大的困难。

为解决这个难题，研究者们主要集中在算法领域寻求破解方案。骆清铭团队独辟蹊径地指出解决大数据困恼的根本策略应是从源头出发提升数据质量，进而提高后续数据处理和分析的效率。他们利用HD-fMOST对稀疏标记了神经元的小鼠全脑进行三维高清双色成像，以0.3×0.3×1微米体素分辨率在5天内获取了12000张冠状面图像及其细胞构筑信息，是目前以相近体素分辨率实现全脑光学成像速度最快的技术。

通过分析发现，原始数据有效信号覆盖16位动态范围，平均信噪比高达110，可直接叠加生成全脑投影图。高清晰度的数据质量使神经元形态的重建速度即使在复杂度增加5倍的情况下仍然提高近2倍。文章中还给出了在线定量统计特定类型神经元的全脑分布结果，平均准确率达到95%，表明HD-fMOST获得的高质量原始数据可支持在线分析。

此外，该技术实现了小鼠全脑10 TB级原始数据集的在线无损压缩，压缩率达到3%，可直接写入U盘或上传云端，有望极大地减少高分辨率全脑三维数据集在数据存储和传输方面造成的负担。

图2 HD-fMOST对稀疏标记特定神经元的小鼠全脑进行高清三维成像的结果

综上，该团队提出的LiMo显微术在快速高分辨率光学成像时能显著提高背景抑制能力。在此基础上发展的HD-fMOST技术不仅极大地提高了全脑光学成像的数据质量，而且对该领域面临的大数据难题开辟了全新的解决途径，在数据存储、传输、处理和分析等方面效率显著提高了效率，有望在标准化、规模化的脑科学研究中发挥巨大作用。

钟秋园博士与李安安教授为并列第一作者，骆清铭院士与袁菁教授为并列通讯作者，金锐博士生、张德洁硕士、李向宁教授、贾雪艳硕士、丁章恒博士生、罗盘博士、周灿博士生、姜辰宇硕士、丰钊博士、张智红教授、龚辉教授为共同作者。研究工作得到科技部重点研发计划、基金委创新群体、国家重大科研仪器研制项目和重大项目等资助。

特别值得关注的是，Nature Methods在同期还刊发了对骆清铭院士的人物专访。在采访中，骆清铭回顾了二十年的MOST研究历程，指出HD-fMOST不是突发奇想一蹴而就的。面对全脑介观神经联接图谱绘制的重大需求，整个团队长期探索研发的工作，是在不断的实验中发现新问题，进而再解决之，推动技术持续创新的成果，将来还会不断地有新方法新技术产出。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01074-x