大豆（Glycine max(L.) Merrill）起源于我国，是世界第一大植物蛋白质和第二大食用植物油脂来源，在国民经济发展和保障国家粮食安全中具有重要地位。值得注意的是，随着人民生活水平的提高，豆粕和豆油需求不断增加，大豆进口量连年增长，自给率仅为15%左右，已成为我国大豆在国际竞争中“卡脖子”的关键因素。然而，大豆作为中度盐敏感型作物，当土壤中盐碱度超过5 dS/m时，大豆产量即可降低50%，对我国粮食安全造成极大影响。因此，充分利用我国内陆盐碱土地，培育耐盐碱大豆新品种（系）已刻不容缓。目前，国内外在大豆耐盐碱基因挖掘及分子机制等方面的研究，主要以NaCl为研究对象，而对NaHCO₃等高pH值盐碱胁迫相关基因挖掘及作用机理的解析报道较少。因此，挖掘大豆耐盐碱基因，解析其调控网络及遗传基础，培育耐盐碱大豆新品种（系）已成为国内外生物育种研究领域的一个前沿内容。

2023年10月海南大学南繁学院李海燕教授团队在国际学术期刊Journal of Agricultural and Food Chemistry （中国科学院1区TOP，IF：6.1）上发表“Comparative proteomic analysis of two wild soybean (Glycine soja) genotypes reveals positive regulation of saline-alkaline stress tolerance by tonoplast transporters”的研究论文。该研究通过对125份不同地区来源的野生大豆盐碱耐受性的鉴定，并借助蛋白质组学分析的方法，分析发现氨基酸代谢、蛋白质合成和液泡膜转运蛋白形成了一个复杂的反馈网络，并影响大豆的盐碱胁迫耐受性。同时，重点研究了差异表达的液泡膜转运蛋白（GsTIP2-1、GsTIP2-2、GsINT1、GsSUC4和GsACA11）参与大豆耐盐碱调控的相关功能，以解析大豆在盐碱胁迫下的潜在分子调控机制。该项目的研究一方面为深入探索大豆盐碱耐受性的分子机制奠定基础；另一方面也为利用分子育种手段培育耐盐碱大豆新品系提供候选基因及新思路。

图1. 盐碱耐受和敏感型野生大豆盐碱特异性差异表达蛋白的功能富集分析

研究者首先对125份不同地区的野生大豆种质进行了盐碱的胁迫处理（100 mM NaCl+50 mM NaHCO₃, pH=9.0），筛选出盐碱耐受型品系SWBY032及盐碱敏感型品系SWLJ092。进一步，利用Tandem Mass Tag™ (TMT™) 蛋白质组测序分析的方法对其盐和盐碱胁迫后样本进行了分析，获得了346个DEPs为盐碱胁迫特异性响应蛋白。同时，功能富集分析结果发现更多的核糖体蛋白在SWLJ092中下调，而更多的膜转运蛋白在SWBY032中上调（图1）。此外，蛋白质-蛋白质相互作用分析结果表明，14个蛋白质合成和2个TCA循环相关的DEPs可能通过影响蛋白质合成和氨基酸代谢来改变盐碱耐受性。重要的是，研究者发现在耐受型野生大豆材料SWBY032中，5个液泡膜相关转运蛋白（GsTIP2-1、GsTIP2-2、GsINT1、GsSUC4和GsACA11）可能参与了野生大豆盐碱耐受性的调控。综上，我们推测氨基酸代谢、蛋白质合成和液泡膜转运蛋白形成了一个复杂的反馈网络，并影响大豆的盐碱胁迫耐受性。

图2 液泡膜转运蛋白（GsINT1, GsTIP2-1, GsTIP2-2, GsACA11 and GsSUC4）亚细胞定位分析

研究者进一步对盐碱耐受型中5个差异表达蛋白（GsTIP2-1、GsTIP2-2、GsINT1、GsSUC4和GsACA11）进行了盐和盐碱胁迫下的基因表达分析，结果表明上述五种蛋白的基因表达和蛋白质组中的蛋白表达趋势基本一致。为了证实上述5个液泡膜差异表达蛋白在液泡膜中发挥功能，研究者通过拟南芥原生质体共定位的方法（液泡膜Marker，AtTPK）对预测结果进行验证，结果表明上述5种蛋白在液泡膜上特异性表达（图2），为后续解析其蛋白功能奠定基础

图3. 盐碱胁迫下过表达液泡膜转运蛋白对大豆复合体植株的表型鉴定

研究者为了鉴定5个液泡膜差异表达蛋白（GsTIP2-1、GsTIP2-2、GsINT1、GsSUC4和GsACA11）的功能，分别进行了酵母异源表达及大豆发状根诱导复合体植株等实验，证实了上述液泡膜转运蛋白可能通过减轻对蛋白质合成和氨基酸代谢的抑制，并发挥协同作用，从而提高大豆盐碱胁迫耐受性（图3）。

综上，该研究表明在耐受型野生大豆材料中氨基酸代谢、蛋白质合成和液泡膜转运蛋白可能形成了一个复杂的反馈网络（图4），从而提高了大豆的盐碱胁迫耐受性。

图4. 野生大豆差异表达蛋白可能参与盐碱胁迫响应的调控网络

海南大学热带大豆分子育种与种质创新团队博士后周永刚、许克恒、高红桃为共同第一作者。海南大学李海燕教授、崖州湾实验室杨新泉研究员、吉林农业大学王法微教授为共同通讯作者。本研究获得了国家自然科学基金、海南省重点研发项目、海南大学高层次人才科研启动经费、崖州湾种子实验室博士后项目的资助。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c02111